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    ca++ mg++- atp酶活性測定說明書
    ca++ mg++- atp酶活性測定說明書
    更新時間:2019-04-18
    訪問量: 448
    廠商性質: 生產廠家

    Ca++ Mg++-ATP 酶活性測定注意事項:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

    ca++ mg++- atp酶活性測定說明書產品概述:

    貨號:YJ2275                                                  規格:50管/24樣

    Ca++ Mg++-ATP 酶活性測定說明書

    可見分光光度法

    產品說明

    Ca++ Mg++-ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中,可催化ATP水解生成ADP和無機磷。根據Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及無機磷,通過測定無機磷的量來確定ATP 酶活性高低。

    需自備的儀器及用品

    可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

    試劑的組成和配制:

    提取液:液體50mL ×1 瓶,4℃保存。

    試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。

    試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。

    試劑三:液體 5ml×1 瓶,4℃保存。

    試劑四:粉劑×3 支,-20℃保存。用時每支加1mL 蒸餾水,現用現配。用不完的試劑-20℃可保存一周。

    試劑五:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。

    試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時加入3mL 蒸餾水, 4℃保存。

    試劑七:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時加入25mL 蒸餾水,溶解后4℃保存一周。

    試劑八:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時加入25mL 蒸餾水,溶解后4℃保存一周。

    試劑九:液體25mL×1 瓶,室溫保存。

    試劑十:10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。

    0.5μmol/mL 標準磷應用液配制:將試劑十20倍稀釋,即取 0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水

    充分混勻

    定磷劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍色則為磷污染,定磷劑現用現配。

    注意:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

    樣品酶液的制備:

    1. 細菌、細胞或組織樣品的制備:

    細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104 個):提取液體積(mL)為500~1000:1 的比例(建議500 萬細菌或細胞加入1mL 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30 次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

    組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱取約0.1g 組織,加入1mL 提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

    1. 血清(漿)樣品:直接檢測。

    操作步驟:

    1. 分光光度計預熱30min 以上,調節波長至660nm,蒸餾水調零。
    2. 酶促反應(在EP 管中加入下列試劑)

     

    對照管

    測定管

    試劑一(μL)

    130

    90

    試劑二(μL)

    40

    40

    試劑三(μL)

    40

    40

    試劑四(μL)

    40

    40

    試劑五(μL)

     

    40

    樣本 (μL)

     

    200

    混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其他物種)準確水浴10min。

    試劑六(μL)

    50

    50

    樣本 (μL)

    200

     

    混勻,8000g,常溫離心10min,取上清液

    1. 定磷(1.5mLEP 管中依次加入下列試劑)

     

    空白管

    標準管

    對照管

    測定管

    0.5μmol/ml 標準磷應用液(μL)

     

    100

     

     

    上清液(μL)

     

     

    100

    100

    蒸餾水(μL)

    100

     

     

     

    定磷試劑(μL)

    1000

    1000

    1000

    1000

    混勻,室溫放置30 min,在 660nm 處比色。

    注意事項:

    1. 由于每一個樣都必須做對照,本試劑盒50管只能測24份Ca++ Mg++-ATP 酶。
    2. 此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。避免磷污染是檢測成敗的關鍵。
    3. 空白管和標準管只要做一管。

    計算

    1. 血清(漿)Ca++ Mg++-ATPase 活力的計算:

    定義:規定每小時每毫升血清(漿)中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

    Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/mL)=[ C 標準管×V 總]×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A空白管)÷V 樣÷T=7.5×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)

    1. 組織、細菌或細胞中Ca++ Mg++- ATPase 活力的計算:
    1. 按蛋白濃度計算:

    定義:每小時每毫克組織蛋白中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

    ATP 酶活力(U/ mg)=[C 標準管×V 總]×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷(V 樣×Cpr)÷T =7.5×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷Cpr

    1. 按樣本鮮重計算:

    定義:每小時每克組織中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個酶活力位。

    Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/g)= [C標準管×V總]×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷(W× V 樣÷V樣總)÷T=7.5×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W

    1. 按細菌或細胞密度計算:

    定義:規定每小時每1萬個細菌或細胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

    Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/104)= [C標準管×V總]×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷(500×V 樣÷V樣總)÷T=0.015×(A測定管-A 對照管)÷(A標準管-A空白管)

     

    C 標準管:標準管濃度,0.5μmol/mL;V 總:酶促反應總體積,0.5mL;V 樣:加入樣本體積,0.2mL ;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,1/6 小時;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細菌或細胞總數,500 萬。

     

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